Unidad de Resistencia a Antibióticos
Bruno González-Zorn
Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria y VISAVET, Universidad Complutense de Madrid
bgzorn@ucm.es
Foto de grupo. Arriba: Cristina Bernabé-Balas, Manuel Ares Arroyo, Gabriel Moyano, Andreas Hoefer, José F. Delgado, Daniel Thomas-López, Alfonso Santos-López. Abajo: Sonsoles Pacho, Laura Carrilero, Bruno González-Zorn, Mónica Suárez. Natalia Montero, Cristina Martínez-Ovejero.
La resistencia a antibióticos, sin embargo, es un fenómeno natural originado por el hecho de que los antibióticos son producidos por microorganismos en el medio ambiente desde hace miles de años, y los mecanismos de resistencia a los mismos vienen existiendo en la naturaleza de forma análoga. Desde que utilizamos los antibióticos clínicamente, entre la Primera y la Segunda Guerra Mundial, estamos seleccionando esos mecanismos allí donde los utilizamos: en granjas, en hospitales y en el medio ambiente, donde acaban mediante su utilización en acuicultura o por las propias aguas residuales (Figura). Aunque la identificación y descripción epidemiológica de los mecanismos de resistencia es interesante y lleva realizándose desde hace varias décadas, nosotros entendemos que la resistencia a antibióticos es un fenómeno ecológico cuyo fundamento abordamos en nuestro grupo (Gonzalez-Zorn y Escudero, 2013). Nuestro objetivo es intentar comprender a nivel básico cuál es el flujo de mecanismos de resistencia a antibióticos en nuestro ecosistema Tierra, utilizando distintas aproximaciones reduccionistas.
Cuando comenzamos nuestra andadura, identificamos un mecanismo de resistencia desconocido hasta ese momento en Escherichia coli. Se trataba de armA (aminoglycoside resistance methyltransferase), una metiltransferasa del ARN 16S que anula la utilidad de todos los aminoglucósidos en la práctica clínica (Gonzalez-Zorn et al. 2005a). Secuenciando la plataforma genética del mismo advertimos cómo este elemento es capaz de ser transferido por conjugación entre enterobacterias y por transposición entre plásmidos de distinta naturaleza(Gonzalez-Zorn et al. 2005b). Desde el primer momento decidimos centrar parte de nuestra actividad en este mecanismo, que proviene originalmente de Streptomyces ambientales productores de aminoglucósidos, los cuales se protegen de su suicidio por la acción de aminoglucósidos que ellos mismos producen precisamente metilando su ribosoma con una metiltransferasa del ARN16S. En colaboración con compañeros de distintos países hemos identificado que este mecanismo se encuentra en patógenos aislados de alimentos (Granieret al. 2011), en animales de producción y de compañía (Hidalgo et al. 2013) y en hospitales (Hidalgo et al. 2012), lo que nos ha permitido conocer las bases de su diseminación a nivel mundial. En paralelo, hemos estudiado cuáles son las consecuencias para un bacteria de metilar un residuo en su ARN16S, habida cuenta de que las bacterias ya metilan un gran número de residuos en su ribosoma para optimizar su funcionamiento. Mediante espectrometría de masas y técnicas bioquímicas complementarias hemos identificado que esta familia de metiltransferasas metila el residuo el residuo m7 del nucleótido G1405 del ARN16S (Gutiérrez et al. 2012). Este hecho modifica el patrón de metilaciones del ribosoma, reprogramándolo en un nuevo estado de metilación cuyas consecuencias estamos estudiando. Hemos observado cómo el fitness cost de estas metiltransferasas es nulo cuando se integran en el cromosoma (Gutiérrez et al. 2013), lo que probablemente sea clave para su diseminación actual en Salmonella (Hopkins et al. 2010).
En esta línea, hemos descubierto una nueva metiltransferasa de esta familia, RmtF, ampliamente distribuida en el Reino Unido y la India (Hidalgo 2013), que también metila el residuo m7G1405 del ARNr 16S. Hemos secuenciado más de 50 plásmidos conjugativos con esta metiltransferasa procedentes de un mismo Hospital en Lucknow (India) para establecer las bases ecológicas y evolutivas que han determinado su aparición y diseminación entre enterobacterias hospitalarias (Rahmanet al. 2014 y datos no publicados).
El estudio de las metiltransferasas y su existencia en bacterias ambientales nos llevó a interesarnos por la captación genética y su transmisión (Gutiérrez et al. 2009). En colaboración con otros grupos, dimos con la implicación del mecanismo SOS en la captación de cassettes de resistencia en los integrones bacterianos (Cambray et al. 2009, Guerinet al. 2010). Desde entonces seguimos trabajando en el sistema SOS como mecanismo de regulación de la resistencia a antibióticos y su diseminación.
La tercera línea de trabajo de nuestro laboratorio se basa en el descubrimiento reciente, de que los plásmidos pequeños tienen una relevancia mucho mayor de lo que ha pensando hasta el momento. Los primeros hallazgos se basaron en la identificación de un plásmido pequeño, pB1000, que confería resistencia a beta-lactámicos en Haemophilus parasuis (San Millán et al. 2007). Poco después determinamos que pB1000 era responsable de esta resistencia también en el patógeno humano Haemophilus influenzae (San Millán et al. 2010), y que él mismo se combina con mutaciones cromosómicas para conferir resistencia a un amplio rango de beta-lactámicos incluyendo cefalosporinas de 3ª generación (San Millán et al. 2010). Posteriormente, identificamos que otros plásmidos pequeños también puede conferir resistencia a beta-lactámicos en H. influenzae (Søndergaard et al. 2012). De hecho, en Pasteurella multocida, la multirresistencia a antibióticos se determina por la acumulación de plásmidos pequeños, en los que cada uno porta uno, máximo dos genes de resistencia a antibióticos, definiendo una nueva forma de multirresistencia a antibióticos en bacterias (San Millán et al. 2009). Cuáles son los motivos por los que para la bacteria es conveniente poseer este nuevo mecanismo de multirresistencia basado en plásmidos pequeños es lo que estamos intentado desentramar. Hemos visto, además, que prácticamente todos los aislados clínicos de enterobacterias poseen, al menos, un plásmido ColE1. Por lo tanto, estos plásmidos pequeños ubicuos parecen tener un papel biológico relevante, en cuya investigación nos estamos centrando.
Figura. Antibiograma. Escherichia coli DH5α mulitirresistente tras la adquisición de un plásmido por conjugación
Una de las aproximaciones de Biología Sintética que estamos llevando a cabo se basa en evolucionar in vitro plásmidos de la familia Pasteurella en E. coli, utilizando esta última bacteria como fábrica de nuevos replicones para su utilización biotecnológica. Esto permitiría ampliar el rango de plásmidos utilizables en diversos procesos, y nos permite a su vez conocer los fundamentos biológicos de la coexistencia y adaptación de plásmidos en bacterias.
Desde que iniciamos el Grupo hemos trabajado en programas de cooperación internacional colaborando con la University for Development Studies en la Región Norte de Ghana. Hemos construido allí un laboratorio de Seguridad Alimentaria que está en funcionamiento actualmente y formado en nuestro laboratorio durante cuatro años a una persona que está actualmente a cargo del mismo (Saba et al, 2012 y 2013). Con la ayuda de la OMS y de la International Foundation for Science estamos ahora equipando el laboratorio microbiológico del hospital, para permitir diagnosticar y tratar adecuadamente las principales infecciones bacterianas. Además, impartimos cursos a sus alumnos y personal de Microbiología y Biotecnología. Actualmente, colaboramos también con la Facultad de Medicina de la Universidad de Balamand, Líbano.
Lo más importante a lo largo de estos años no han sido nuestros hallazgos ni proyectos o publicaciones. Lo más importante ha sido la confianza que tantos grupos nacionales e internacionales han depositado en nosotros para colaborar, para enviarnos a sus investigadores y para aceptarnos en los suyos. Especialmente, gracias a los primeros que confiaron en un grupo recién creado para realizar sus Tesis o Postdoc: JA Escudero, A San Millán, L Hidalgo, S Matrat y CKS Saba.
Bibliografía representativa
Cambray G, Sánchez-Alberola N, Campoy S, Guerin E, Da Re S, González-Zorn B, Ploy MC, Barbé J, Mazel D, Erill I. (2011)
Prevalence of SOS-mediated control of integron integrase expression as an adaptive trait of chromosomal and mobile integrons. Mob DNA. 30;2(1):6.
Escudero, J.A., San Millán, A., Catalán, A., G. de la Campa, A., Rivero, E., López, G., Domínguez, L., Moreno, M.A., González-Zorn, B. (2007)
First characterization of fluoroquinolone resistance in Streptococcussuis. Antimicrob Agents Chemother 51: 777-782.
Escudero, J.A., San Millán, A., Gutiérrez, B., Hidalgo, L., La Ragione, R.M., Abuoun, M., Galimand, M., Ferrándiz, M.J., Domínguez, L., de La Campa, A.G., González-Zorn, B. (2011)
Fluoroquinolone efflux in Streptococcus suis is mediated by SatAB and not by SmrA. Antimicrob Agents Chemother 55: 5850-5860.
Escudero, J.A., San Millán, A., Montero, N., Gutiérrez, B., Ovejero, C.M., Carrilero, L., Gonzélez-Zorn, B. (2013)
SatRis a repressor of fluoroquinolone efflux pump SatAB. Antimicrob Agents Chemother 57: 3430-3433.
González-Zorn, B., Escudero, J.A. (2013)
Ecology of antimicrobial resistance: humans, animals, food and environment. IntMicrobiol 15: 101-109.
González-Zorn, B., Teshager, T., Casas, M., Porrero, M.C., Moreno, M.A., Courvalin, P., Domínguez, L. (2005a)
armA and aminoglycoside resistance in Escherichia coli. Emerg Infect Dis 11: 954-956.
González-Zorn, B., Teshager, T., Porrero, M.C., Moreno, M.A., Domínguez, L. (2005b)
Genetic basis for the dissemination of armA. J Antimicrob Chemother 56: 583-585.
Granier, S.A., Hidalgo, L., San Millán, A., Escudero, J.A., Gutíérrez, B., Brisabois, A., González-Zorn, B. (2011)
ArmA methyltransferase in monophasic Salmonella enterica isolated from food. Antimicrob Agents Chemother 55: 5262-5266.
Gutiérrez, B., Douthwaite, S., González-Zorn, B. (2013)
Indigenous and acquired modifications in the aminoglycoside binding sites of Pseudomonas aeruginosa rRNAs. RNA Biol 10: 1324-1332.
Gutiérrez, B., Escudero, J.A., San Millan, A., Hidalgo, L., Carrilero, L., Ovejero, C.M., Santos-López, A., Thomas-López, D., González-Zorn, B. (2012)
Fitness cost and interference of Arm/Rmt aminoglycoside resistance methyltransferases with the RsmF housekeeping methyltransferase. Antimicrob Agents Chemother 56: 2335-2341.
Gutiérrez, B., Herrera-León, S., Escudero, J.A., Hidalgo, L., González-Sanz, R., Arroyo, M., San Millán, A., Echeita, M.A., González-Zorn, B. (2009)
Novel genetic environment of qnrB2 associated with TEM-1 and SHAV-12 on pB1004, an IncHI2 plasmid, in Salmonella Bredeney BB1047 from Spain. J Antimicrob Chemother 64: 1334-1336.
Hidalgo, L., Gutiérrez, B., Ovejero, C.M., Carrilero, L., Matrat, S., Saba, C.K., Santos-López, A., Thomas-López, D., Hoefer, A., Suárez, M., Santurde, G., Martín-Espada, C., González-Zorn, B. (2013)
Klebsiella pneumoniae sequence type 11 from companion animals bearing ArmA methyltransferase, DHA-1 Beta-lactamase, and QnrB4. Antimicrob Agents Chemother 57: 4532-4534.
Hidalgo, L., Hopkins, K.L., Gutiérrez, B., Ovejero, C.M., Shukla, S., Douthwaite, S., Prasad, K.N., Wodford, N., González-Zorn, B. (2013)
Association of the novel aminoglycoside resistance determinant RmtF with NDM carbapenemase in Enterobacteriaceae isolated in India and the UK. J Antimicrob Chemother 68: 1543-1550.
Hidalgo, L., Hopkins, K.L., Wareham, D.W., Gutiérrez, B., González-Zorn, B. (2012)
Association of extended-spectrum Beta-lactamase VEB-5 and 16S rRNA methyltransferase armA in Salmonella enterica from the United Kingdom. Antimicrob Agents Chemother 56: 4985-4987.
Hopkins, K.L., Escudero, J.A., Hidalgo, L., González-Zorn, B. (2010)
16S rRNA Methyltransferase RmtC in Salmonella enterica ser. Virchow. Emerg Infect Dis 16: 712-715.
Rahman, M., Shukla, SK., Prasad, K.N., Ovejero, C.M., Pati, B.K., Tripathi, A., Singh, A., Srivastava, A.K., González-Zorn, B. (2014)
Prevalence and molecular characterisation of New Delhi metallo-beta-lactamases NDM-1, NDM-5, NDM-6 and NDM-7 in multidrug-resistant Enterobacteriaceae from India. Int J Antimicrob Agents 44: 30-37.
Saba, C.K., Escudero, J.A., Herrera-León, S., Porrero, M.C., Suárez, M., Dominguez, L., Demuyakor, B., González-Zorn, B. (2013)
First identification of Salmonella Urbana and Salmonella Ouakam in humans in Africa. J Infect Dev Ctries 7: 691-695.
Saba, C.K.S., González-Zorn, B. (2012)
Microbial food safety in Ghana: a metha-analysis. J Infect Dev Ctries 6: 828-835.
San Millán, A., Escudero, J.A., Catalán, A., Nieto, S., Farelo, F., Gibert, M., Moreno, M.A., Domínguez, L., González-Zorn, B. (2007)
Beta-lactam resistance in Haemophilus parasuis is mediated by plasmid pB1000 bearing blaROB-1. Antimicrob Agents Chemother 51: 2260-2264.
San Millán, A., Escudero, J.A., Gutiérrez, B., Hidalgo, L., García, N., Llagostera, M., Domínguez, L., Gonzélez-Zorn, B. (2009)
Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother 53: 3399-3404.
San Millán, A., García-Cobos, S., Escudero, J.A., Hidalgo, L., Gutiérrez, B., Carrilero, L., Campos, J., González-Zorn, B. (2010)
Haemophilus influenzae clinical isolates with plasmid pB1000 bearing blaROB-1. Fitness cost and interspecies dissemination. Antimicrob Agents Chemother 54: 1506-1511.
San Millán, A., Giufre, M., Escudero, J.A., Hidalgo, L., Gutiérrez, B., Cerquetti, M., González-Zorn B. (2011)
Contribution of ROB-1 and PBP3 mutations to the resistance phenotype of a Beta-lactamase-positive amoxicillin/clavulanic acid-resistant Haemophilus influenzae carrying plasmid pB1000 in Italy. J Antimicrob Chemother 66: 96-99.
Søndergaard A, San Millán A, Santos-López A, Nielsen SM, González-Zorn B, Nørskov-Lauritsen N. (2012)
Molecular organization of small plasmids bearing blaTEM-1 and conferring resistance to β-lactams in Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother. 56(9):4958-60.
Zacharczuk K, Piekarska K, Szych J, Jagielski M, Hidalgo L, San Millán A, Gutiérrez B, Rastawicki W, González-Zorn B, Gierczynski R. (2011)
Plasmid-borne 16S rRNAmethylase ArmA in aminoglycoside-resistant Klebsiella pneumoniae in Poland. J Med Microbiol. 60:1396-11.