Biología Molecular de la Patogenicidad de Brucella
Felix Sangari y Juan M García Lobo.
Instituto de Biomedicina y Biotecnología. Universidad de Cantabria-CSIC
sangarif@unican.es
Foto de grupo. De izquierda a derecha, Félix J. Sangari, Juan M. García Lobo, Asunción Seoane, Candela González-Riancho e Íñigo Pariza.
La brucelosis es una zoonosis producida por diversas bacterias del género Brucella, como B. melitensis, B. abortus y B. suis. En los animales que constituyen su hospedador natural, como vacas, cabras u ovejas, dan lugar a abortos e infertilidad principalmente, mientras que en los humanos la enfermedad se manifiesta como un síndrome febril que puede progresar a una fase crónica caracterizada por la aparición de severas complicaciones como endocarditis, artralgia, epididimitis o neurobrucelosis. Si no se trata, la brucelosis crónica representa una amenaza, especialmente en áreas endémicas, como América Central y Sudamérica, Oriente Próximo, los países mediterráneos, el norte de Africa y los países del Caúcaso y Asia Central. Se maneja la cifra de unos 500.000 casos humanos nuevos cada año, aunque probablemente esta cifra esté infravalorada y sea 4 ó 5 veces superior. Una de las peculiaridades de este género bacteriano, y que explica en gran manera su éxito, es que carece de factores de virulencia clásicos, y más bien ha desarrollado una estrategia furtiva, de modificación de sus patrones moleculares asociados a patógenos para evitar ser reconocido en primera instancia por el sistema inmune innato, y lograr éxito en la infección.
Nuestro trabajo sobre Brucella se inició con el desarrollo de métodos para la manipulación genética del género. Utilizamos de forma pionera la mutagénesis por trasposición en Brucella y fruto de aquellos esfuerzos obtuvimos varios mutantes sobre los que hemos desarrollado muchos de nuestros proyectos posteriores. Sin dudas, de todos ellos el que realmente perseguíamos y consideramos uno de nuestros mejores logros fue un mutante que era sensible al eritritol. Brucella es uno de los pocos géneros bacterianos capaces de utilizar eritritol como fuente de carbono y además se estableció una relación muy sugerente entre la presencia de eritritol en la placenta de los ungulados y la capacidad abortiva de B. abortus. Otro argumento que animaba nuestro trabajo, era que la cepa vacunal de B. abortus S19 era era también sensible al eritritol. La caracterización de nuestro mutante erynos llevó a caracterizar un operón que contiene genes para el catabolismo del eritritol dentro deun agrupamiento mayor que contiene genes para transporte del eritritol y otros genes del metabolismo de carbohidratos , todos ellos inducibles por la presencia de eritritol en el medio de cultivo. Sorprendentemente encontramos que la cepa vacunal S19, sensible a eritritol, ha sufrido una delección que afecta a dos genes esenciales del operón.
El trabajo de caracterización genética se complementaba con experimentos de infección en cultivos celulares y en ratones tratando de establecer el lazo de conexión entre el metabolismo del erirtritol y la virulencia de Brucella. Concretamente uno de los sistemas más correlacionados con la virulencia de Brucella ha resultado ser un sistema de secreción de tipo IV, que se conoce como el operón vir de Brucella. La regulación por eritritol del operónvir, y por ende de la virulencia de Brucellaha sido una de nuestras hipótesis más perseguidas.
En una vertiente más aplicada, hemos tratado de explotar nuestros hallazgos, primero en el desarrollo de procedimientos diagnósticos de identificación de la cepa vacunal S19, basados en nuestros datos de secuencia, que resolvieran el problema de la diferenciación entre animales vacunados y animales infectados.
Otra aplicación de este trabajo contempla el desarrollo de vacunas para la brucelosis bovina construidas introduciendo de forma controlada mutaciones en los genes del eritritol y el operon de la ureasa, otro de los factores de virulencia que hemos caracterizado en Brucella. La ureasa, de modo similar a lo que ocurre en Helicobacter pylori, le sirve a Brucella para sobrevivir al pH ácido del estómago, e infectar al huésped por vía gastrointestinal, como es el caso más habitual de infección en humanos. Un mutante ΔureΔery debería tener por un lado abolida la capacidad de producir abortos mediada por el uso del eritritol y al mismo tiempo ser más segura para el hombre al disminuir la capacidad de producir una enfermedad en el hombre cuando se ingiere la bacteria a través de productos lácteos contaminados. En la actualidad estamos tratando de utilizar mutantes Δery para producir una vacuna basada en B. melitensis que sería protectora para cabras.
La secuenciación de genomas y el desarrollo de diferentes “ómicas” ha dado una nueva dimensión a nuestro trabajo. En esta línea comenzamos corrigiendo la anotación del genoma de B. melitensis 16M y la nueva anotación la utilizamos para construir el ORFeoma de Brucella, una colección ordenada de plásmidos conteniendo todos los ORF’s del genoma (Dricot et al., 2004). Con el ORFeoma construimos un microarray que fue utilizado para un primer análisis transcripcional de la respuesta de al eritritol (Rodríguez et al., 2012)asi como para el análisis de la respuesta transcripcional de los mutantes en el sistema de dos componentes bvrR/S (Viadas et al., 2010). Posteriormente hemos incorporado la caracterización del transcriptoma por secuenciación profunda de mRNA. Con esta tecnología completamos el análisis transcriptómico de la respuesta al eritritol lo que reveló profundos cambios en el metabolismo de carbohidratos en respuesta a este compuesto que deben estar en la base de la observada asociación con la inducción de abortos por Brucella en rumiantes. También colaboramos en el proceso de secuenciación del genoma de Brucellaovis (Tsolis et al., 2009), la especie que causa brucelosis en ovejas y carneros que tiene un gran interés entre otras cosas por ser una especie “rugosa” pero aun patógena para animales. Además esta especie muestra una actividad demostrable de una secuencia de inserción denominada IS711 (Ocampo-Sosa and García-Lobo, 2008), de la que existen unas 25 copias en contraposición de las 5-7 copias que se encuentran en las especies patógenas para el hombre.
Posteriormente hemos incorporado la caracterización del transcriptoma por secuenciación profunda del RNA (RNAseq). Con esta tecnología completamos el análisis transcriptómico de la respuesta al eritritol lo que reveló profundos cambios en el metabolismo de carbohidratos en respuesta a este compuesto que deben estar en la base de la observada asociación con la inducción de abortos por Brucella en rumiantes. En la actualidad hemos llevado a cabo el análisis transcripcional por RNAseq direccional lo que nos ha permitido identificar una colección de posibles RNAs pequeños (sRNA) que probablemente jueguen un papel importante en la regulación de la expresión en Brucella. En concreto estamos caracterizando dos de estos sRNAs que por su localización pudieran estar regulando la expresión del sistema de secreción tipo IV de Brucella, lo que de alguna manera nos vuelve a enfrentar a nuestra vieja hipótesis de la relación entre virulencia y eritritol a través de la regulación del operón vir de Brucella.
El grupo de “Biología Molecular de la Patogenicidad de Brucella” desarrolla su actividad investigadora desde Agosto de 2013 en el Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (IBBTEC) (http://web.unican.es/ibbtec/), a donde se trasladó tras estar localizado durante más de 20 años en la Facultad de Medicina de la Universidad de Cantabria. En este nuevo entorno disponemos de más infraestructuras, más espacio, además de estar rodeados por grupos afines con los que compartimos metodología y equipamiento científico similares.
Bibliografía representativa
Dricot, A., Rual, J.-F., Lamesch, P., Bertin, N., Dupuy, D., Hao, T., Lambert, C., Hallez, R., Delroisse, J.-M., Vandenhaute, J., et al.(2004)
Generation of the Brucella melitensis ORFeome version 1.1. Genome Res. 14, 2201–2206.
Ocampo-Sosa, A.A., and García-Lobo, J.M. (2008).
Demonstration of IS711 transposition in Brucella ovis and Brucella pinnipedialis. BMC Microbiol. 8, 17.
Rodríguez, M.C., Viadas, C., Seoane, A., Sangari, F.J., López-Goñi, I., and García-Lobo, J.M. (2012).
Evaluation of the Effects of Erythritol on Gene Expression in Brucella abortus. PloS One 7, e50876.
Sangari, F.J., Pérez-Gil, J., Carretero-Paulet, L., García-Lobo, J.M., and Rodríguez-Concepción, M. (2010).
A new family of enzymes catalyzing the first committed step of the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 14081–14086.
Tsolis, R.M., Seshadri, R., Santos, R.L., Sangari, F.J., Lobo, J.M.G., de Jong, M.F., Ren, Q., Myers, G., Brinkac, L.M., Nelson, W.C., et al. (2009).
Genome degradation in Brucella ovis corresponds with narrowing of its host range and tissue tropism. PloS One 4, e5519.
Viadas, C., Rodríguez, M.C., Sangari, F.J., Gorvel, J.-P., García-Lobo, J.M., and López-Goñi, I. (2010).
Transcriptome Analysis of the Brucella abortus BvrR/BvrS Two-Component Regulatory System. PLoS ONE 5, e10216.